巰嘌呤類(lèi)藥物屬于嘌呤類(lèi)抗代謝藥物,包括6-硫鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)、6-巰基嘌呤(6-MP)和硫唑嘌呤(AZA)等,常用于白血病(如ALL和AML)和炎癥性疾?。ㄈ缈肆_恩病等)的治療。在細(xì)胞中,巰嘌呤類(lèi)藥物轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物6-thio-(d)GTP,摻入到基因組原料中,引起無(wú)效DNA修復(fù),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。NUDT15是NUDIX(Nucleosidediphosphate linked to moiety X, NUDIX)水解酶超家族成員,與NUDT1(MTH1)類(lèi)似,但其對(duì)氧化型核苷酸的代謝較弱。
NUDT15主要參與巰嘌呤類(lèi)藥物活性代謝產(chǎn)物6-thio-(d)GTP的代謝清除。有關(guān)NUDT15的文獻(xiàn)主要集中在最近5年,目前對(duì)其生理功能仍知之甚少。臨床研究發(fā)現(xiàn)NUDT15基因多態(tài)性(如R139C)與巰嘌呤類(lèi)藥物造血系統(tǒng)毒性升高顯著相關(guān)。在細(xì)胞及小鼠體內(nèi),敲除NUDT15可有效提高6-thio-(d)GTP的濃度。在NUDT15敲除小鼠中,巰嘌呤類(lèi)藥物的給藥劑量可降低20倍而不影響抗白血病療效。這表明現(xiàn)有基于巰嘌呤的治療方法可通過(guò)靶向NUDT15的6-thio-(d)GTP酶活性進(jìn)行調(diào)控。因此,來(lái)自瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)了一種選擇性NUDT15抑制劑TH1760,并系統(tǒng)評(píng)價(jià)了其與巰嘌呤類(lèi)藥物合用在AML中的潛在臨床用途。
首先,研究人員利用酶聯(lián)孔雀石綠高通量篩選方法,對(duì)17946個(gè)化合物進(jìn)行篩選,根據(jù)抑制活性、潛在的結(jié)合效率及成藥性,選擇37個(gè)候選化合物進(jìn)行劑量效應(yīng)驗(yàn)證,進(jìn)而得到化合物TH884(IC50=7 μM),作為NUDT15抑制劑開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)。研究人員對(duì)TH884進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究,通過(guò)對(duì)右側(cè)苯環(huán)進(jìn)行改造,最終得到先導(dǎo)化合物TH1760(IC50=25 nM)。在一系列與NUDT15序列或功能相似的蛋白中,TH1760對(duì)NUDT15具有非常好的選擇性。TH1760可劑量依賴性提高NUDT15的熱穩(wěn)定性,提示其直接結(jié)合在NUDT15上。
為了進(jìn)一步闡明TH1760的作用機(jī)制,研究人員通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)獲得了TH1760與NUDT15共晶結(jié)構(gòu)。從復(fù)合物結(jié)構(gòu)看,TH1760以6-thio-GMP相似的取向進(jìn)入NUDT15的底物口袋。與6-thio-GMP的鳥(niǎo)嘌呤類(lèi)似,TH1760的苯并惡唑酮與Gly137骨架形成直接氫鍵。TH1760苯并惡唑酮的羰基與Leu138骨架以及磺胺基團(tuán)與Thr94之間還形成了另外2個(gè)氫鍵。酰胺的O和吲哚的N分別與Arg34和Glu88之間形成水分子介導(dǎo)的相互作用。與6-thio-GMP相比,TH1760與NUDT15共晶中這些增加的相互作用賦予TH1760與NUDT15之間的高度親和力。
然后,研究人員分別利用CETSA實(shí)驗(yàn)和DARTS實(shí)驗(yàn)證明TH1760可進(jìn)入細(xì)胞,與胞內(nèi)NUDT15結(jié)合。由于NUDT15活性喪失無(wú)明確的表型,但NUDT15控制巰嘌呤類(lèi)藥物的藥效,因此,研究人員利用巰嘌呤類(lèi)藥物抑制白血病細(xì)胞增殖作為表型,并以此研究抑制細(xì)胞內(nèi)NUDT15的作用。TH1760可通過(guò)抑制NUDT15,劑量依賴性增強(qiáng)AML細(xì)胞系NB4和HL-60對(duì)巰嘌呤類(lèi)藥物的敏感性,并且在一系列血液細(xì)胞系中得到確認(rèn)。研究人員進(jìn)一步研究了TH1760在克服巰嘌呤類(lèi)藥物耐藥性方面的作用,發(fā)現(xiàn)TH1760可增強(qiáng)6-TG耐藥性細(xì)胞系HCT116對(duì)6-TG的敏感性。在同源成纖維細(xì)胞BJ-hTERT(未轉(zhuǎn)化)和BJ-RAS細(xì)胞(表達(dá)SV40大T抗原和HRAS)中,TH1760對(duì)BJ-RAS細(xì)胞的6-TG增敏作用強(qiáng)于BJ-hTERT細(xì)胞,提示TH1760可能會(huì)增大巰嘌呤類(lèi)藥物的治療窗。
最后,研究人員利用同位素標(biāo)記的6-MP或未標(biāo)記的6-TG處理HL-60細(xì)胞,通過(guò)測(cè)定DNA的放射性或直接測(cè)定6-thio-(d)GTP的含量,表明TH1760對(duì)巰嘌呤類(lèi)藥物的增敏作用是通過(guò)對(duì)NUDT15的抑制,導(dǎo)致巰嘌呤類(lèi)活性代謝產(chǎn)物的增多所致,與DNA損傷及DNA損傷修復(fù)反應(yīng)等增加一致。
作為First-in-class選擇性NUDT15抑制劑,TH1760有助于揭示NUDT15的生理功能。TH1760可通過(guò)抑制NUDT15,增強(qiáng)巰嘌呤類(lèi)藥物的藥效,或者降低藥物劑量,克服耐藥性,其在AML上的臨床應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
1. Zhang SM, Desroses M, Hagenkort A, et al. Development of a chemical probeagainst NUDT15. Nat Chem Biol. 2020;16(10):1120-1128.