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攻克技術(shù)難題 提高檢測質(zhì)量 第三代基因測序技術(shù)和相關(guān)產(chǎn)品簡介

發(fā)布日期:2022-04-07   來源:醫(yī)藥網(wǎng)   瀏覽次數(shù):0
核心提示:高通量測序技術(shù)(也稱為第二代測序技術(shù))對于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)或基因組的某個位置上的小

高通量測序技術(shù)(也稱為第二代測序技術(shù))對于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)或基因組的某個位置上的小片段序列(長度通常小于50bp)的插入或缺失(insertion-deletion,InDel)檢測較準(zhǔn)確,但是對于較大的結(jié)構(gòu)變異檢測卻非常困難。第三代測序技術(shù)以不需要PCR擴增和長讀長為標(biāo)志,實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序,因此也被稱為單分子測序技術(shù)。目前,已有長讀長測序的第三代測序平臺實現(xiàn)商業(yè)化,并廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域,且有望在不久的將來用于臨床,進一步提高基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢出率。
 
  測序技術(shù)不斷升級
 
  2008年,Helicos BioSciences公司推出了全球第一款單分子測序平臺HeliScope,但該產(chǎn)品的序列讀長較短,系統(tǒng)整體測序錯誤率較高。隨后,針對單分子的長讀長測序技術(shù)出現(xiàn)。目前,長讀長測序平臺是指單分子測序長度不低于KB級別的技術(shù)平臺。如今,已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化的長讀長測序平臺主要有Pacific Biosciences公司的單分子實時測序(single molecule realtime sequencing,SMRT)平臺和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔測序(Nanopore)平臺。
 
  單分子實時測序平臺
 
  Pacific Biosciences公司開發(fā)的第三代測序技術(shù)稱為SMRT,該技術(shù)建立在兩項重要發(fā)明的基礎(chǔ)之上,有效攻克了測序領(lǐng)域測序讀長短的重大難題。其中,零模波導(dǎo)孔(zero-mode waveguides,ZMWs)技術(shù)可使激發(fā)光被限定在單分子納米孔底部的一定范圍之內(nèi),有效過濾背景噪音;熒光基團通過結(jié)合在核苷酸的磷酸基團上,能夠幫助DNA聚合酶完成一個全天然的DNA鏈合成過程。
 
  基于該原理的具體產(chǎn)品有PacBio Sequel測序儀、PacBio Sequel Ⅱ測序儀。PacBio Sequel測序儀是率先實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的第三代測序技術(shù)產(chǎn)品,其突破了傳統(tǒng)短讀長測序的諸多技術(shù)瓶頸。PacBio Sequel Ⅱ測序儀是PacBio Sequel的升級款,可提供CLR Library和CCSlibrary(HIFI)兩種測序模式,其測序芯片上的導(dǎo)孔(ZMW)由100萬個增至800萬個,理論通量較PacBio Sequel測序儀提升了8倍。同時,CCS reads(測序片段)的單堿基準(zhǔn)確度也有了較大提升,同一片段在測序4次后,準(zhǔn)確度可達約99%。
 
  納米孔單分子測序平臺
 
  Nanopore是基于電信號測序的技術(shù),原理是通過電場力驅(qū)動單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道,不同的堿基在通過納米孔道時會產(chǎn)生不同阻斷程度和阻斷時間的電流信號,因此可根據(jù)電流信號識別每條核酸分子上的堿基信息,從而實現(xiàn)對單鏈核酸分子的測序。由于該測序技術(shù)的原理與其他平臺有較大差異,亦被稱為第3.5代或第四代測序技術(shù)。
 
  Nanopore測序儀的具體產(chǎn)品種類較多,均為基于Nanopore芯片而搭建的平臺,大到由多個芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測序儀,小到可以連接手機Type C接口、電腦USB接口的MnION系列便攜式測序儀。其中,PromethION是一款高通量、高樣本數(shù)的臺式系統(tǒng),其具有48個測序芯片,每個芯片有多達3000個納米孔通道,總計達 14.4萬個納米孔通道?;谶@種模塊化設(shè)計,測序芯片既可單獨運行也可同時運行,尤其適用于大樣本量、具有龐大數(shù)據(jù)量的項目。
 
  上述兩類第三代測序平臺均具有長讀長、無GC偏好性以及可直接檢測甲基化修飾等優(yōu)點。相較而言,SMRT平臺無錯誤偏好,可通過增加數(shù)據(jù)糾錯以提高測序準(zhǔn)確度;Nanopore平臺讀長更長,可達到Mb級別,其中MnION測序儀的尺寸如手機大小,較為便攜(詳見表)。
 
  應(yīng)用方向有待探索
 
  目前,長讀長測序的第三代測序平臺已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領(lǐng)域的科研項目中,以解決上述領(lǐng)域中檢測技術(shù)的瓶頸問題。
 
  在疾病檢測方面,第三代測序技術(shù)基于其單分子檢測與長讀長測序的特點,在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測、短串聯(lián)重復(fù)序列(微衛(wèi)星DNA)分析、單體型分析、真假基因區(qū)分、甲基化檢測等方面具有獨特的優(yōu)勢。盡管目前許多基于第二代測序技術(shù)的基因診斷產(chǎn)品已基本成熟,但因高通量測序技術(shù)存在讀長短、對基因組覆蓋不均勻等局限,對SNP和InDel s檢測尚可,但對復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的檢測卻無能為力。而第三代測序技術(shù)憑借長讀長、不需要PCR擴增、無GC偏好性等優(yōu)勢,在用于腫瘤、遺傳病等基因檢測時,能夠進行長片段序列(長度通常大于50bp)測定,可以檢測缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)變異,進一步提高了疾病的檢出率,有效彌補了第二代測序技術(shù)對結(jié)構(gòu)變異檢測的不足。
 
  相較于第二代測序平臺,第三代測序平臺大幅提升了序列讀長,但由于其錯誤率、成本及對樣本要求都較高,算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套技術(shù)仍需進一步研究,目前該平臺仍處于科研項目應(yīng)用階段。針對上述問題,各平臺正不斷優(yōu)化升級相關(guān)技術(shù),如PacBio測序儀的HIFI技術(shù)模式可有效提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度,Nanopore平臺也通過對Promet hION進行設(shè)備升級以進一步提高檢測準(zhǔn)確度。相信隨著第三代測序平臺的不斷發(fā)展,其未來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用后,將有效彌補目前針對基因組結(jié)構(gòu)變異等相關(guān)疾病檢測手段的空白。(作者單位:國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心)
 
 
 
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